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标题: 单克隆抗体下游工艺病毒清除能力的研究 [打印本页]

作者: guolvfenlitech6 时间: 2021-11-9 08:42
标题: 单克隆抗体下游工艺病毒清除能力的研究

2021-11-09 环球过滤分离技术网 guolvfenlitech6

来源于细胞系的生物技术产品可能存在病毒污染的风险，其程度取决于包括原材料、生产系统、纯化试剂等多种因素。在生物制品进入临床试验和上市之前，必须证明其生产过程具有清除已知和假定病毒的能力。单克隆抗体生产过程对病毒的去除或灭活作用，能够降低病原性病毒医源性传播的潜力，是降低风险的关键组成部分。

如何评估下游工艺的病毒清除能力

通常是通过将已知滴度的指示病毒加入到不同生产工艺阶段的中间品中，测定经特定工艺处理后样品中残留病毒的滴度，计算出病毒滴度对数下降值（log reduction value，LRV）进行评价。对于LRV≥4log10的工艺步骤一般可认为是有效的病毒清除步骤。LRV＜4log10的工艺有助于提高生产过程总病毒清除率。但由于病毒验证的局限性，LRV≤1log10的工艺对于病毒清除意义不大[1]。
采用模拟生产工艺（缩小的工艺）的方法时，应尽量设计与实际生产工艺相关及合理的病毒去除/灭活研究方案，模拟的工艺在试验参数及控制条件方面应与实际工艺严格保持一致。

常用指示病毒和验证方案

常用的指示病毒如表 1所示。在新药研究申请（investigational new drug，IND）阶段，生物技术产品需要对至少两种病毒进行清除验证。在生物制品许可申请（biologics license application，BLA）阶段，通常使用3-5种特异性/非特异性病毒进行病毒清除研究，并评估3-5个工艺步骤，以从病毒安全性的角度证明产品具有足够的安全系数。由于国内外指导原则不同，用于申报的病毒清除验证方案和步骤存在差异（见表 2）。

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下游工艺对不同病毒的清除能力

截止至2009年，向FDA提交的IND和BLA的单抗产品的数据显示[2]，对于逆转录病毒，除了阳离子交换层析CEX（结合-洗脱模式）的LRV约3log10外（图 1a），其他工艺均能够稳健地清除（LRV≥4log10）。疱疹病毒与逆转录病毒的清除效果相似且LRV>4log10 (图 1b)。小型无包膜病毒如细小病毒则较难有效清除，它们对化学处理具有耐受性，且不易被过滤器截留（图 1c）。只有阴离子交换层析AEX（流穿模式）和小型病毒过滤器能够有效清除细小病毒（平均LRV>4log10）。

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图 1下游工艺对逆转录病毒（a）、疱疹病毒（b）和细小病毒（c）的清除作用
图中工艺依次为protein A、AEX（流穿模式）、CEX（结合-洗脱模式）、Low pH灭活（“不完全”与“完全”清除）以及大孔径与小孔径的除病毒过滤。

影响下游工艺病毒清除能力的因素

下游各工艺的LRV值分布情况见图 2。将0–2log10的研究归为低LRV组，大于6log10的研究归为高LRV组进行对比分析。
Protein A亲和层析
Protein A工艺的LRV值与平衡/洗涤缓冲液、填料、洗脱液组成及洗脱pH值均无明显相关性。低LRV组的共同点是原料相当复杂，可能是复杂的原料与填料间的相互作用，对层析柱去除病毒的能力产生了负面影响。
AEX（流穿模式）
研究表明AEX（流穿模式）上样的pH值和电导率可以影响LRV[3]。而对FDA数据的统计结果显示，AEX（流穿模式）的LRV与不同缓冲液、填料、pH和电导率等变量无明显相关性，可能原因是申报的案例工艺条件中优化了pH和电导率。
CEX（结合-洗脱模式）
CEX工艺对病毒清除作用不够稳健。高LRV组的LRV与缓冲液、经验水平或层析柱性质（如柱高和树脂类型）无明显相关性。然而，高LRV研究中使用的平衡/上样及洗脱pH值均较低为5.3±0.2，而低LRV组中pH为6.0±0.2。缓冲液中盐浓度是引起LRV值差异的另一个重要因素。低LRV研究使用的缓冲液中盐浓度较高，上样/平衡液中平均290±120 mM NaCl，洗脱液中340±70 mM NaCl，而高LRV的研究中NaCl的浓度分别为58±27 mM和183±31 mM。
Low pH灭活
Low pH工艺中，pH值是一个关键过程参数，pH 3.8足以灭活逆转录病毒[4]。其中，低LRV研究组的pH值为3.9，而高LRV研究中pH值为3.4。
除病毒过滤
不论是小孔径还是大孔径的滤器，清除MuLV的LRV值均不低于2log10，且只有1%的研究低于3log10（图 2h和i）。大孔径病毒过滤器对逆转录病毒的总体清除率低于小孔径滤器(图 1c)。影响细小病毒清除结果的主要与过滤器类型有关。

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图 2下游工艺在不同LRV范围的分布情况
图中工艺依次为protein A（a）、AEX流穿模式（b）、CEX结合-洗脱模式（c）、AEX结合/洗脱模式（d）、Low pH灭活（“不完全”与“完全”清除）（e-g），以及大孔径（h）与小孔径（i-j）的除病毒过滤。其中a–i：逆转录病毒，j：细小病毒。

病毒安全性评估的创新与挑战

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生物制药下游工艺领域不断的发展，也将相应地引起病毒清除技术的创新[5]。在大规模生物制药工业生产领域，特别是高风险高技术操作难度的low pH病毒灭活工艺中，进行有效混合的同时需要确保生物药物的安全性。白帆生物引入了新型磁性一次性混合系统，并与FlexAct自动控制平台整合，可实现low pH孵育病毒灭活的全自动控制。在线pH检测及超洁净、低剪切混合的特性，能有效提高病毒灭活的速度及收率，减少生物制品在不利环境中的暴露时间，大大降低交叉污染和生物负荷引入的风险。

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白帆生物拥有经验丰富的专业技术团队，具有成熟稳定的表达及纯化工艺平台，覆盖从研发、小试、中试到规模化生产的完整产业链。作为国内一次性使用技术与商业生产及CDMO服务结合的时代领军者，白帆生物与Cytiva和Satorius等国际企业强强联合，在上海建立了针对各类肿瘤和自身免疫性疾病的单克隆抗体药物产业化基地，拥有独特的NONCROS®多产品共线生产技术、智能信息化管理系统、高表达量的宿主细胞平台等，可有效缩短新药上市时间，提高有效产能，降低成本和风险。

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参考文献[1] ICH Q5A(R1): Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 1998.[2] Miesegaes G, Lute S, Brorson K. Analysis of viral clearance unit operations for monoclonal antibodies. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 106(2):238-246.[3] Strauss, D. M., Lute, S., Tebaykina, Z. et al. Understanding the mechanism of virus removal by Q sepharose fast flow chromatography during the purification of CHO-Cell derived biotherapeutics. Biotechnology and Bioengineering, 2010,104(2):371-380.[4] Brorson K, Krejci S, Lee K. et al. Bracketed generic inactivation of rodent retroviruses by low pH treatment for monoclonal antibodies and recombinant proteins. Biotechnology and Bioengineering, 2008, 32(3):321-329.[5] Shukla A A, Aranha H. Viral clearance for biopharmaceutical downstream processes. Pharmaceutical Bioprocessing, 2015, 3(2):127-138
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