病毒清除工艺验证法规、原理及公司整理

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2023-09-09          环球过滤分离技术网            guolvfenlitech5

一、法律法规要求

国际上关于生物制品病毒安全性控制已经出台了一系列技术要求和指导原则，各国技术要求或指导原则均具有其科学性、规范性及严谨性，但各自的适用范围不完全一致，且生物制品不断推陈出新，国际指导原则也在不断更新以建立更完善的生物制品安全准则。在国内，NMPA在2020年初发布了11个ICH指导原则的公告，同时在2020年版的中国药典中也增加了生物制品病毒安全性控制的内容，进一步推动了生物制品注册技术标准国际化。部分指导原则的理念和内容的细节方面正日渐与国际接轨，但国内指导原则仍然不能完全满足生物制品快速发展的需求。早期上市的生物制品对于病毒安全性控制(除病毒工艺验证)略有差异，没有全面验证除病毒工艺验证相关的工艺步骤，特别是对于经长期临床应用安全性可控的急需品种，如抗血清制品、疫苗产品等。

加之由于国内在病毒安全性控制方面的指导原则相对较少，我国药典也没有明确的要求，所以相关的技术方法、手段等的普及程度、成熟度较低。另外，关于清除病毒验证的相关具体要求，国内和国外主流要求在个别方面略有差异，但国内目前正在积极推进生物制品注册技术标准国际化，各项标准均在向ICH Q5A(国际通用的针对人或动物细胞系生产的生物技术 产品上市阶段病毒安全性评价的指南)的要求靠拢。美国、欧盟法规建立相对较早，体系相对健全；国内法规发布较晚，主要在参照美国、欧盟法规的基础上，结合自身实际，做了一定的完善。随着国外申报或中外双报的生物制品企业越来越多，本文整理了关于国内外病毒清除验证法律法规及遵循的指导原则，见表2。

国内外病毒清除验证法律法规

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现代生物制品经常使用动物细胞来作为蛋白表达生产系统，以保证产物的正确构象和活性，比较常见的一种就是中国仓鼠卵巢细胞系（CHO细胞）。作为啮齿类动物细胞，CHO细胞常表达内源性逆转录病毒样颗粒，在细胞上清中通常可检测到103～109/mL逆转录病毒样颗粒。这些颗粒形态、生化性质、序列等与传染性逆转录病毒相似。二、如何进行病毒清除工艺验证

CHO细胞培养过程中有可能发生外源性病毒污染，各国药监机构要求临床试验前和生产阶段前的申报材料中，纯化工艺必须经过病毒清除/灭活验证，以确保无论是临床试验患者注射用，还是推向市场的产品，均不会出现病毒污染，酿成重大医疗事故。

病毒清除/灭活环节在生物制品产业链中的位置

以下将从指示病毒选择、常见工艺选择、细胞毒性和病毒干扰研究、检测方法、每剂量病毒颗粒估算、再验证六个方面来阐述如何进行病毒清除工艺验证。

1. 指示病毒选择

根据ICH Q5A、《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则》、《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》的要求，需要选择不同类型的指示病毒，对于层析系统用于证明病毒灭活效果所针对的病毒类型需要进行充分考虑，如亲和层析通常在低pH灭活工艺之前，涉及的病毒种类可能更为丰富，并没有要求所有的病毒类型在一步工艺中均能有效去除，因此需要考虑毒种类型，《生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案》中提到的病毒可以作为一个参考。

当生产工艺参数在一定范围内变化时，对于病毒清除的效果也可能会有差异。为了在病毒清除工艺验证中能覆盖生产工艺操作参数的所有范围，对于一些关键操作参数应考虑采用对病毒清除效果最差的工艺条件。

3. 细胞毒性和病毒干扰研究

由于细胞毒性和病毒干扰性会严重影响病毒滴度的测定结果，因此在工艺中间品中加入病毒研究病毒清除效果时，为了准确评估样品中实际的病毒滴度，需要对工艺中间品进行细胞毒性和病毒干扰性研究。

细胞毒性研究是根据工艺中间品对指示细胞形态的影响来判定样品是否对细胞有毒。一般情况下，在指示细胞中加入不包含病毒的工艺中间产物，通过一段时间的培养，观察指示细胞的细胞形态有无明显变化。根据细胞形态的变化，可以判定产品的细胞毒性。

病毒干扰是指样品会干扰病毒在细胞中的增殖或病变检测。病毒干扰研究需在指示细胞中加入工艺中间产物，然后用已知量的病毒去侵染细胞。通过对比病毒在有无工艺产物加入的指示细胞中的滴度，来评估病毒干扰性。需要注意的是不能用细胞毒性来评估病毒干扰性，因为低细胞毒性的样品可能具有强烈的病毒干扰性。

4. 用于病毒清除研究的检测方法

在病毒清除工艺验证中，应尽可能选择灵敏度高的病毒检测方法。用于病毒清除研究的检测方法应经验证，具体包括灵敏度、特异性、重复性、缓冲液/基质对病毒感染力的干扰、可能影响选用指示病毒对细胞感染能力的产品及缓冲液的细胞毒性分析等。

目前常用的病毒检测方法有蚀斑形成、细胞病变、核酸定量、免疫荧光或其他方法。

5. 每剂量病毒颗粒估算

每剂量病毒颗粒估算适用于起始数目可以估算的病毒，如内源性逆转录病毒。在计算病毒下降因子时，应注意对照料液的病毒滴度与起始加毒料液的病毒滴度有无明显差异。如果没有明显差异，可以说明在病毒清除研究过程中病毒滴度无明显下降，因此在计算病毒下降因子时，可以利用起始加毒料液与病毒清除后料液的病毒总滴度对数差值进行计算，否则应利用对照料液与病毒清除后料液的病毒总滴度对数差值进行计算。根据《生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案》给出的经验值，不同的层析系统可以下降2~5个log的水平，通常我们建议毒种浓度应当大于目标值至少1个log，以防止去除后病毒无法检出的情况，进而无法计算实际去除效果。

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