支原体检查---菌种简介

guolvfenlitech6 · 发表于 2022-10-12 06:38:51

2022-10-12 环球过滤分离技术网 guolvfenlitech6

菌种和培养基是微生物实验过程必不可少的两部分。同样支原体标准菌株和其培养基同样是支原体检查需要关注的两个重点。接下来对质量控制用支原体分类、支原体复苏传代保藏和支原体生物安全三部进行学习。

PART 01

质量控制用支原体的分类

我们药典中提到的支原体有肺炎支原体（ATCC15531）和口腔支原体（ATCC23714），他们分别与支原体肉汤培养基和精氨酸支原体肉汤培养基对应，分别作为糖发酵型支原体和精氨酸分解型支原体的代表。

而EP和USP的规定的质量控制检测用支原体菌株并不局限于口腔支原体和肺炎支原体，具体详情如下表。

01

自问自答

问：怎么理解中国药典质量控制菌株与欧美药典规定的质控菌株不同？

答：

（1）.细胞培养物被支原体污染是极普遍的问题，其中95%以上是由口腔支原体（M. orale）、精氨酸支原体（M. arginini）、发酵支原体（M. fermentans）、莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）和猪鼻支原体（M. hyorhinitis）5 种造成。除污染细胞的几种常见支原体外，还包括污染牛睾丸细胞的牛支原体（M. bovis），以及污染鸡胚的鸡毒支原体（M. gallisepticum）等。

(2)考虑细胞培养物污染的途径是多种的且不同的支原体其生理特性不同，因此欧美药典列入的质控菌株是常见的代表支原体。

(3)《中国药典》实际上自2005年版以来并未进行过大改动，对应无菌检查和非无菌产品的微生物限度检查两部分，个人以为可能还是沿袭了支原体营养类型的不同来选择代表菌株的思路来执行的。同时也可能考虑药典普适性和我国生物制品企业良莠不齐的现状，没有规定过多种类的质量控制菌株。

问：对于一个生物制品企业如何选择自己的质量控制菌株？

答：

(1).对于培养基的验收，肺炎支原体（ATCC15531）和口腔支原体（ATCC23714）即可满足我们培养基质量验收的需求。理由：为确保培养基的质量首先要做好培养基供应商管理和新培养基的开发研究，日常验收可以从简；

(2)对于样品检验方法建立时，建议参考欧美药典来选择多种支原体来作为阳性实验支原体，可以结合原料、辅料及工艺可能引入的支原体污染评估结果来决定选择那些支原体。3.考虑成本，结合1和2选择适合自己的质控菌株。毕竟ATCC菌株来自 ATCC ( American typeculture collection，美国菌种保藏中心)，增加质控菌株肯定会增加成本，同时在当下背景下时间成本也会明显增加。

问：中国药典是否会引入其他几种ATCC菌株作为质控菌株？

答：

短期内中国药典不会照搬欧美药典，但是也不会限制企业使用更多的质控支原体。长期来说中国毕竟加入了ICH，同时也在努力与国际接轨，其他几种ATCC菌株会被引入，特别是对于QPCR等新的替代方法的验证时应会要求更多的质控支原体。所以个人以为在QPCR等新方法引入的同时其他几种支原体也可能会列入中国药典。

PART 02

关于支原体的复苏与传代

对于菌种的使用我们除了要了解菌种其本身的性质外，在传代和复苏前还是需要参考菌种的COA和使用说明来进行菌种的复苏和传代。因为没有Lot无法在ATCC官网下载相关信息，只能在网上寻找其他老师总结的复苏和传代的信息。

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支原体的复苏

按支原体不同的复苏步骤

取冻存的粉末状猪鼻支原体（肺炎支原体、莱氏无胆甾支原体、发酵支原体、牛支原体）菌株用磨砂石打开安瓿瓶，加入2mL的PPLO肉汤液体培养基稀释。充分混匀后，取1mL于无菌试管中，加入1mL的PPLO肉汤液体培养基，按1：1比例接种，防止37℃5%二氧化碳培养箱中培养2-3天。

取冻存的粉末状口腔支原体（精氨酸支原体）菌株用磨砂石打开安瓿瓶，加入2mL的PPLO肉汤液体培养基稀释，充分混匀后，取1mL于无菌试管中，加入1mL含0.1%精氨酸的PPLO肉汤液体培养基种，按1：1比例接种，防止37℃5%二氧化碳培养箱中培养2-3天。

取冻存的鸡毒支原体（衣阿华支原体、滑液支原体、絮状支原体、小鸡支原体、鸡支原体、鸭支原体）菌株用磨砂石打开安瓿瓶，加入2mL修改的FM4液体培养基稀释，充分混匀后，取1mL于无菌试管中，加入1mL含修改FM4液体培养基种，按1：2比例接种，防止37℃5%二氧化碳培养箱中培养2-3天。

备注：

以上步骤仅供参考，培养基肯定是需要替换，其次培养时间值得商榷。

PPLO肉汤液体培养基：350mL的PPLO肉汤基础液加入100mL健康猪血清、50mL酵母浸出液（25%）、50万单位的青霉素、0.5mL的酚红试液（1%），调pH值到7.6~7.8，4℃备用。

FM-4基础液：将NaCl2.5g、KCl0.2g、MgSO4.7H2O 0.1g、Na2HPO4.12H2O 0.8g、KH2PO40.005g、葡糖糖5.0g及水解乳蛋白2.5g溶于400mL三蒸水（dddH2O）中，待完全溶解后，定容至500mL，放置高压灭菌锅内，115℃15min湿热灭菌，4℃保存备用。

修改FM-4液体培养基：在390mL的FM-4基础液中加入60mL健康煮血清、50mL的酵母浸出液（25%）、50万单位的青霉素、1mL酚红（1%）及0.5mL的NAD（1%），调节pH值至7.6~7.8，4℃保存备用。

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通用版本的活化步骤

按照随附说明打开小瓶。

使用1ml移液器，移取0.5ml规定的肉汤培养基水化冻干粉。并混匀。

通过从原始管中转移0.25mL至含有2.5mL的管进行连续稀释。稀释是重要的，可保持支原体培养处于不同的生长阶段。一旦达到酸性或碱性条件，许多菌株将迅速消亡。

液体培养基在密闭容器内培养，使用未接种的肉汤管作为阴性对照。

可以接种平板以检查菌落形态。在37℃ 5%CO2中生长。固体培养基在微需养中培养，并保持充足湿度，防止琼脂表面干燥。

口腔支原体接种到液体培养基里，在48到72小时内，在前几个稀释管中会出现中等到轻度的混浊。固体培养基上出现菌落需要更长培养时间。肺炎支原体菌株生长更缓慢（文献提到为：96h到103h），并且产生非常轻的浊度。可根据颜色变化来决定何时终止培养。从红色到橙色到黄色的指标变化很容易识别。当培养基为橙色时，支原体最好转移传代。变为黄色后，支原体已经开始死亡。

图1-肺炎支原体各个培养阶段颜色变化（来源于微生物研究所公众号，仅供学习交流）

左：培养前期呈红色

中：培养前中期呈橙色

右：培养后期呈黄色

图2-支原体肉汤培养基中的肺炎支原体（来源于北京三药公众号，仅供学习交流）

图3-口腔支原体ATCC 23714在精氨酸支原体肉汤的生长状态（来源于北京三药公众号，仅供学习交流）

02

支原体的传代

传代操作同复苏活化的步骤类似，不同点在于复苏的时候是1：1接种，活化的时候建议1：10接种。

ATCC培养基与中国药典培养基区别较大，很多老师都提到按ATCC菌种说明书规定的培养基进行传代效果更好；其次按照《中国药典》中规定，应使用灭能新生牛血清，某些老师建议适当加大新生牛血清比例或用胎牛血清代替新生牛血清。

传代的过程还需要注意传代结束后选择适宜的倍数进行后续保藏；

传代时需要及时终止培养，避免支原体死亡。

对于菌种我们会进行纯度和特性的确认，同样支原体检查的时候我们也应进行纯度和特性的确认。

《不同来源药品支原体检查用培养基的促生长能力研究》通过对对灵敏度、变色程度、菌落计数和菌落直径四个定量检验方法来评价培养基的促生长能力。

我们也可以借鉴这种方法进行支原体的特性判断；纯度确认同其他菌种一样在固体培养基上进行形态大小及镜检进行初步确认，如可能进行菌种鉴定。

图4-口腔支原体和肺炎支原体的菌落镜检图（来源于微生物研究所公众号，仅供学习交流）

03

固体培养基上的支原体形态特征

《易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征》一文指出：

菌体浓度对支原体在固体培养基上形态有影响，当菌体浓度稀释至102～ 103 cfu /mL 时，可观察到支原体在固体培养基中呈典型的“油煎蛋”形态。当菌体浓度大于 103cfu /mL 时，支原体在固体培养基上很难形成“油煎蛋”状，在镜下观察菌体没有中心核区，支原体仅仅在固体培养基表面生长，形成的细小菌落边缘光滑整齐，胞质均一，分布均匀。

这可能是因为菌体浓度较大时，培养基提供给菌体的营养有限，支原体向培养基内部及四周生长均受限。在同一视野下区分支原体、细胞残渣、气泡对检定人员对支原体形态的辨识度要求较高，细胞残渣在固体培养基上没有均一的形态，边缘不整齐。而气泡在镜下观察则中心部分由于透光率高，镜下观察中心明亮，四周较暗。只有很好的区分出三者的区别才能在检测中减少误判、错判的概率。

（图片来源于傅元欣,魏然,宣俊文,于佳,王轶峰,姜宝芹,刘晓凡.易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征[J].微生物学免疫学进展,2015,43(05):17-22.DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2015.05.004.仅供学习交流用）

培养时间对支原体形态有影响，研究发现支原体一般在 2 ～ 3 天后才会在固体培养基上呈现出“油煎蛋”形态，其中赖氏支原体在固体培养基上生长速度最快，形成典型菌落的时间也最短，培养5 天后，支原体菌落边缘由平滑变得粗糙，菌落颜色也逐渐加深。

（图片来源于傅元欣,魏然,宣俊文,于佳,王轶峰,姜宝芹,刘晓凡.易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征[J].微生物学免疫学进展,2015,43(05):17-22.DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2015.05.004.仅供学习交流用）

碳源对支原体形态有影响，支原体按其代谢途径分为葡萄糖发酵型和精氨酸水解型。支原体的生长都需要外源性胆固醇、核酸前体、氨基酸、长链脂肪酸、维生素等，实验发现改变碳源会导致肺炎支原体生长受限或代谢抑制，不仅菌体浓度减低，且其形态在固体培养基上变化显著，镜下观察仅能看到菌体外周，不易辨认。

血清的种类对支原体在固体培养基上的形态也有一定影响，用牛血清代替马血清为支原体提供外源的胆固醇后发现，猪鼻支原体形态变化显著，其他支原体形态变化较小。

支原体在液体培养基中根据其细胞形态可分为两类: 一类在其形态上有明显的两极，并包含有一个末端结构用来吸附宿主细胞( 如肺炎支原体) ，这类支原体一般采用二分裂式进行繁殖，且胞质分裂必须与基因复制完全同步; 另一类不含末端结构的无极性分支状支原体，其形态类似于螺旋状纤丝，这类支原体被认为是一种“二级体”，由母体释放得到，其胞质分裂滞后于基因复制。实验观察了不同生长期支原体在固体培养基上的形态，发现支原体进入对数生长期后，其在固体培养基上多呈现“双黄蛋”形态，这说明实验研究的这几种支原体基本采用均等二分裂的形式繁殖，快速生长时，还可以察到“多黄蛋”形态。而在延滞期、稳定期和衰退期则呈现典型的“油煎蛋”形态。

由上文可知我们使用固体培养基进行支原体形态确认时需要注意明确培养时间、菌液浓度、培养基成分等做明确要求，这些都需要进行研究后落实到支原体形态鉴定SOP中，不能单纯规定“油煎蛋”形态。

04

关于支原体的保藏

关于支原体的保藏，《支原体菌株低温保存活力稳定性研究》一文研究结论为：口腔支原体在－70 ℃条件下冻存时，冻存初期 1 个月内菌落数稍有降低，但进入休眠状态后，冻存 1 年期间，其菌落数差异无统计学意义，表明冻存时间对口腔支原体的活力影响较小，冻存的长期稳定性较好; 但在－35 ℃ 条件下冻存 12 个月，菌种活力明显低于－70 ℃冻存的结果，表明口腔支原体对储存温度的敏感性相对较高，超低温储存有利于保持其菌种活力。肺炎支原体在－70 ℃ 条件下冻存时，菌种迅速进入休眠期，冻存 1 年期间，其菌落数差异也无统计学意义，冻存时间对肺炎支原体的活力影响较小，冻存的长期稳定性较好; 在－35 ℃条件下冻存 12 个月的菌种活力与－70 ℃ 冻存的结果相比，菌落数未发生明显改变，表明肺炎支原体对冻存温度的敏感度较低，稳定性高。因此，支原体菌种冻存温度应选择相对较低温度，冻存周期在 1 年内较为稳定，也可在经过验证的存储期限内保存，但不宜过长，以避免产生变异关于支原体的生物安全问题。

参考其研究结果我们可以暂定保藏温度为-70℃或更低。有老师提及液氮储存是最好的方法，有条件进行支原体冻干保存，在2~8℃下可无限期保存。个人建议跟菌种保存一样采用10%甘油保存法，因为甘油冷冻法成本低操作方便。

10%甘油保存法：支原体生长后，将处于含对数期的支原体的培养基高速离心收集，肺炎支原体建议9000rpm离心30分钟，口腔支原体自己评估。倒去上清液，再悬浮于适量相应的新鲜肉汤培养基中。加入等量的20%甘油，甘油终浓度为10%。

PART 03

支原体相关的生物安全问题

01

什么条件下进行阳性实验

由《中国药典》三部的生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制项下查到肺炎支原体及口腔支原体危害程度分类为三类，同微生物实验室常用菌种的危害程度分类相同，因此阳性实验在BSL2等级下生物安全室进行实验即可。当然如果由BSL3生物安全实验室，在着装特殊防护服具有定向气流和进入制度保证条件下进行实验会更安全。

为规避洁净服重复利用引入生物安全风险和增加工作量个人建议进行阳性实验的洁净服可以是一次性洁净服。

02

实验室废弃物的处理

跟通常的阳性实验室废弃物一样处理。需要满足国家危险废物处理的相关规定。

作者：杋稞

博普智库创作者

在细微处做足功夫的微生物检验人

参考文献

[1] 《中国药典》2020年版（四部）3301支原体检查法

[2] 小叶，微生物研究所（公众号）口腔和肺炎支原体活化保种总结及中欧美药典在支原体培养上的差异 2018-09-19 13:38

[3] 魏然,傅元欣,于佳,宣俊文,高雪军.支原体菌株低温保存活力稳定性研究[J].微生物学免疫学进展,2019,47(02):36-39.DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2019.02.006.

[4] 张博,马乐,薄晓菲,王雨,孙远,牛明春.支原体肉汤培养基的优化及效果评价[J].生物化工,2020,v.6;No.31(06):79-81.