Catalent对澄清技术的研究与3M™ Harvest RC的应用

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2023-09-08.         环球过滤分离技术网           guolvfenlitech3

实验背景 - Catalent 对层析式澄清的探究

过去几年中，工艺简化与强化策略已成为生物工艺优化的主流方向，以便生产更高效的单克隆抗体（mAb）。过去几十年，应用平台技术（如: 使用中国仓鼠卵巢CHO细胞为表达平台）已成为行业内的一种标准实践，以简化生产工艺，提高效率和灵活性。

Catalent康泰伦特采用各类澄清技术混合使用的方式应对细胞密度日益提高的挑战，以达到预期澄清效果。然而，细胞培养工艺的提高使得细胞密度（＞25 x 106个细胞/ml）、细胞生产率与滴度提高的同时伴随着杂质增多的独特挑战，为下游纯化工艺增加负担。

本研究探索出一种新型阴离子交换（AEX）层析法，专门设计的一次性技术用于细胞培养的收获。通过对比多种一次性澄清技术，对其达到的效果与节省的费用进行探讨，以了解使用新型一次性层析技术澄清产生的影响。

实验概述 - 方案设计

对三种不同的澄清方式进行评估，探讨层析式澄清带来的影响（图1）。第一种采用3M™ Zeta Plus™ EXT系列深层过滤器60SP02A作为评价深层过滤器性能的基本标准。第二种采用3M™ Emphaze™ AEX复合澄清膜和初级深层过滤器结合的方式来探索层析式澄清方式的效果。最后，采用单级层析式澄清技术，即3M™ Harvest RC层析式澄清产品。

本研究使用Catalent提供的具有过程强化的CHO细胞培养技术，生产重组单克隆抗体（mAb 1、mAb 2 和 mAb 3）。如表1所示，本研究使用两种采用GPEx CHO细胞开发技术表达的IgG抗体和采用GPEX Boost CHO细胞开发技术表达的Fc融合蛋白。

此外，为了更好的理解这种新型层析式澄清技术带来的经济效益，本研究使用BioSolve构建商品成本（CoGs）模型，探讨其对单克隆抗体（mAb）产品生产成本的影响。建模的关键参数见表2。

三种不同澄清方式的结果对比见图3A和3B。

动态光散射（DLS）显示，深层过滤滤液中观察到三种不同的类群（图3A）。一个与0.01µm相对应的峰值，这个目标蛋白质类峰相一致。不过，在0.01µm与1µm之间还观察到另外两个峰值，这

表明了DNA、染色质和细胞碎片的存在。

两种层析式澄清方式滤液的DLS分布均以0.01µm为中心单分散粒径分布，这个正好与包括单克隆抗体（mAbs）在内的蛋白质类物质峰值一致。这表明，利用层析法去除DNA、染色质和细胞碎片后，滤液中最主要的物质即为相关产品。

更干净的澄清滤液对Protein A捕获步骤性能产生的影响进一步进行评估。相较于传统深层过滤，这两种层析式澄清方法在澄清操作中对于宿主细胞蛋白质的降低效果只有少许改进（图3B）。然而，最大的影响还是在下游的Protein A捕获步骤中，澄清工艺有助于去除DNA污染物的干扰，最终提高Protein A洗脱液的纯度。

层析式澄清方式对于Protein A的优化，主要表现在清洗和酸性洗脱这两个操作单元。结果发现，使用两种层析方式的滤液经过ProteinA 时，在清洗和洗脱步骤只有少量的杂质结合到ProteinA，因此ProteinA 洗脱液中杂质含量更少，这意味着可以减轻Protein A 操作单元的负担，有利于提高其循环使用周期和性能提升。

结果分析 - 三种不同澄清方式对比

本研究探讨了使用纤维状AEX介质（Harvest RC层析式澄清产品）进行层析式澄清的概念。现行的层析式澄清法在去除小颗粒和可溶性杂质前，需要先采用多级去除大颗粒杂质。本研究评估了在层析式澄清步骤中，使用单级层析式澄清方式的可能性。该技术将季胺功能团嫁接到聚丙烯纤维层。使用扫描电镜（SEM），观察到细胞被吸附和捕获到该技术的纤维层上（图2）。此外，还发现该技术也可以有效去除DNA/染色质等可溶性污染物，有助于后续的下游工艺。

同澄清方式的结果对比见图3A和3B。

动态光散射（DLS）显示，深层过滤滤液中观察到三种不同的类群（图3A）。一个与0.01µm相对应的峰值，这个目标蛋白质类峰相一致。不过，在0.01µm与1µm之间还观察到另外两个峰值，这表明了DNA、染色质和细胞碎片的存在。

两种层析式澄清方式滤液的DLS分布均以0.01µm为中心单分散粒径分布，这个正好与包括单克隆抗体（mAbs）在内的蛋白质类物质峰值一致。这表明，利用层析法去除DNA、染色质和细胞碎片后，滤液中最主要的物质即为相关产品。

更干净的澄清滤液对Protein A捕获步骤性能产生的影响进一步进行评估。相较于传统深层过滤，这两种层析式澄清方法在澄清操作中对于宿主细胞蛋白质的降低效果只有少许改进（图3B）。然而，最大的影响还是在下游的Protein A捕获步骤中，澄清工艺有助于去除DNA污染物的干扰，最终提高Protein A洗脱液的纯度。

层析式澄清方式对于Protein A的优化，主要表现在清洗和酸性洗脱这两个操作单元。结果发现，使用两种层析方式的滤液经过ProteinA 时，在清洗和洗脱步骤只有少量的杂质结合到ProteinA，因此ProteinA 洗脱液中杂质含量更少，这意味着可以减轻Protein A 操作单元的负担，有利于提高其循环使用周期和性能提升。

3M™ Harvest RC - 降本增效

我们探讨将 Harvest RC 层析式澄清产品用作单步层析式澄清所造成的成本影响。利用实验结果建立一个BioSolve成本分析模型。对比传统两级深层澄清方式，将层析式澄清产品中资金、原材料、耗材、劳动力和其他成本等因素考虑进去。单级层析式澄清方法，CoGs提高16%。这主要归结为工艺压缩成单级，从而降低产生的耗材废料，而且层析式澄清方法也提高了产量。

我们探讨将 Harvest RC 层析式澄清产品用作单步层析式澄清所造成的成本影响。利用实验结果建立一个BioSolve成本分析模型。对比传统两级深层澄清方式，将层析式澄清产品中资金、原材料、耗材、劳动力和其他成本等因素考虑进去。单级层析式澄清方法，CoGs提高16%。这主要归结为工艺压缩成单级，从而降低产生的耗材废料，而且层析式澄清方法也提高了产量。

实验总结 - 3M™ Harvest RC具明显优势

本研究首次展示如何利用层析法在单级澄清步骤中捕获各种不同细胞培养条件的完整细胞、细胞碎片和可溶性杂质。总之，研究结果表明，Harvest RC适用于过去、现在和未来具有挑战性的细胞培养，此外，层析式澄清法更利于纯化。与传统澄清技术相比，优势包括减少DNA、提高回收率、稳健的可扩展性以及提高纯度。

经济模型进一步支持该案例研究，研究结果显示，Harvest RC有助于降低单克隆抗体（mAb）的生产成本，减少对环境造成的影响。优势具体体现为改善产品回收率，另外操作简便，更快和更简化的工艺等其他因素也起一定的作用。

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