超滤膜的截留分子量

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2021-07-15   环球过滤分离技术网   nanopuretech1

定义：对有孔材料孔径大小的一种描述。在能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的分子量即为该材料的截留分子量。大于截留分子量的分子，被材料截留；小于截留分子量的分子，则可自由通过。截留分子量是凝胶过滤介质、半透膜、超滤膜等材料的重要技术参数。

截留分子量（MWCO:molecular weight cutoff）是使用分子量大小表示的超滤膜的截留性能。又称作切割分子量。

由于直接测定超滤膜的孔径相当困难，所以使用已知分子量的球状物质进行测定。如膜对被截留物质的截留率大于90％时，就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能，称为膜的截留分子量。实际上，所使用的物质并非绝对的球形，由于试验条件的限制，所测定的截留率也有一定的误差，所以截留分子量不能绝对表示膜的分离性能。

超滤膜截留分子量测定

一、    实验目的

（1）    掌握超滤膜截留分子量测定的基本方法和途径。

（2）    了解不同标准溶液对膜截留性能表征的差异。

（3）    掌握蛋白质的测定方法。

二、    实验原理

截留分子量是指在一定条件下，某些分子量的物质被膜截留，被截住物质的最小分子量即为膜的截留分子量，用以表征膜的分离能力。由于直接测定超滤膜的孔径相当困难，所以使用已知分子量的球状物质进行测定。如果膜对被截留物质的截留率大于90%时，就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能，称为膜的截留分子量。实际上，所使用的物质并非绝对的球形，由于实验条件的限制，所测定的截留率也有一定的误差。加之，膜的制备方法决定了膜孔本身的尺寸大小并不是一致，而是围绕某一中心值呈现一定的分布。因此，截留分子量并不能完全代表膜的分离能力。

本实验使用紫外分光光度法测试平板超滤膜对两种不同分子量大小的蛋白质溶液的截留效果。根据透过液中蛋白质含量，计算超滤膜截留率，估算平板超滤膜孔径大小，确认平板膜的性能。实验原理如下：

配制不同分子量的蛋白质溶液，分别用紫外分光光度法测试通过平板膜前后蛋白质溶液浓度的变化，计算出平板超滤膜对不同分子量蛋白质的截留率，估算膜的截留分子量。

三、    实验装置与设备

图1 实验装置图

1、自制平板膜过滤装置一套，含隔膜泵、压力表、流量计、膜组件支架等单元，如图1所示。

2、超滤平板膜，截留分子量约为50 kDa。使用前膜片浸泡在去离子水中。

3、紫外分光光度计；

4、千分之一电子天平；

5、PH计；

6、容量瓶、吸管、烧杯等；

7、去离子水；

8、卵清蛋白（分子量45000）：卵蛋白片；

9、牛血清白蛋白（分子量67000）：生化试剂。

10、氯化钠（NaCl）：分析纯；

11、氯化钾（KCl）：分析纯；

12、磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯；

13、磷酸氢二钾(K2HPO4）：分析纯；

14、HCl：分析纯；

四、    实验步骤

1、蛋白溶液标准曲线的绘制

a、0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制方法

  称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。保存于4℃冰箱中即可。(PBS的作用就是不影响蛋白质变质)

   需要注意的是，通常所说的浓度0.01 M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。

b、高浓度牛血清蛋白标准曲线的绘制

  精确称取牛血清白蛋白1.000 g溶于上面配置的1L磷酸盐缓冲溶液的容量瓶中，分别吸取混合好的牛血清白蛋白溶液0、10、20、30、40、50 mL于50 mL比色管中加去离子水稀释至刻度，配制成浓度为0、200、400、600、800、1000 mg/L的牛血清蛋白标准溶液。

  蛋白质对278 nm的紫外线由最大吸收，蛋白质溶液278 nm吸收值与其浓度成正比。将标准溶液于波长278 nm下，用1 cm比色皿，在紫外分光光度计上测定吸光度，去离子水为空白。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，制出标准曲线。

c、低浓度牛血清蛋白标准曲线的绘制

  精确称取牛血清白蛋白0.100 g溶于上面配置的1L磷酸盐缓冲溶液的容量瓶中，分别吸取混合好的牛血清白蛋白溶液0、10、20、30、40、50 mL于50 mL比色管中加去离子水稀释至刻度，配制成浓度为0、20、40、60、80、100 mg/L的牛血清蛋白标准溶液。

  蛋白质对278 nm的紫外线由最大吸收，蛋白质溶液278 nm吸收值与其浓度成正比。将标准溶液于波长278 nm下，用1 cm比色皿，在紫外分光光度计上测定吸光度，去离子水为空白。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，制出标准曲线。

d、低、高浓度卵清蛋白标准曲线的绘制（同b、c）

表2 高蛋白质标准曲线测试原始数据

序号	标准溶液浓度（mg/L）	吸光度	空白吸光度	校正吸光度
1	0
2	200
3	400
4	600
5	800
6	1000

表3 低蛋白质标准曲线测试原始数据

序号	标准溶液浓度（mg/L）	吸光度	空白吸光度	校正吸光度
1	0
2	20
3	40
4	60
5	80
6	100

2、牛血清蛋白溶液截留分子量的测定

  a、用去离子水清洗平板膜组件，并将其安装至实验装置上（图1）。

  b、熟悉实验装置，链接管路，将阀门调至全开状态。

  c、称取0.5g牛血清蛋白加入配置好的1L磷酸盐缓冲溶液（现用现配），配制成浓度为500 mg/L的牛血清蛋白溶液。配制的蛋白质溶液作为平板膜性能评价使用。

  d、配置好的样品溶液倒入水槽，打开隔膜泵，膜组件在内压正压式条件下运行。在0.1MPa常温条件下，通过平板膜运转，接取30ml左右的产水。测定原液与过滤液的吸光度，从标准曲线上查得相应的浓度。由式（1）计算截留率。

                     （1）

  其中，Ru表示截留率，%；c1表示原液中蛋白质浓度，mg/L；c2表示透过液中蛋白质浓度，mg/L。

3、卵清蛋白溶液截留分子量的测定

  a、b步骤相同

  c、称取0.5g卵清蛋白加入配置好的1L磷酸盐缓冲溶液（现用现配），配制成浓度为500 mg/L的卵清蛋白溶液。配制的蛋白质溶液作为平板膜性能评价使用。

  d、配置好的样品溶液倒入水槽，打开隔膜泵，膜组件在内压正压式条件下运行。在0.1MPa、常温条件下，通过平板膜运转，接取30ml左右的产水。测定卵清蛋白原液与过滤液的吸光度，从标准曲线上查得相应的浓度，并计算截留率。

表2 截留分子量测试原始数据

截留物质	组别	原液吸光度 （A）	透过液吸光度 （A）	相对标准偏差 （%）
牛血清蛋白	1
	2
	3
	平均
卵清蛋白	1
	2
	3
	平均

五、    实验结果整理

1、绘制测定牛血清蛋白和卵清蛋白的标准曲线。

2、根据实验结果判断实验用平板膜组件的截留分子量。

表4 截留分子量测试

目标物质	原液平均浓度 （mg/L）	透过液平均浓度 （mg/L）	相对标准偏差 （%）	截留率 （%）
牛血清蛋白
卵清蛋白

六、    实验结果讨论

1、分析影响截留分子量测试结果的因素及原因。

2、分析不同目标物质测量截留分子量结果的差异及原因。

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