使用中空纤维切向流过滤（HF TFF）优化高浓度抗体工艺

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2023-11-04            环球过滤分离技术网             guolvfenltech5

背景/介绍

抗体（Abs），或免疫球蛋白（Ig），被广泛用于许多不同的科研和治疗性应用1。特别是，单克隆抗体（mAbs）在诊断、蛋白质纯化以及医疗应用中的使用显著增加2-5。妨碍治疗性mAbs使用的一个主要障碍是皮下注射需要使用较高的浓度，因为这是优先选择的给药方法。按FDA要求，皮下给药时，注射体积应低于1.5ml，这就意味着，制剂的浓度需高于100mg/ml7。但是，如此高浓度的mAb制剂对生产来说会是不小的挑战，问题包括稳定性、溶解性、高粘度以及聚集8,9。Ab制剂也会有相似的问题。

相比平板膜包过滤器，中空纤维切向流过滤（HF TFF）是高浓度Abs制剂制备的一种极佳的方法，因为纤维内腔呈现非湍流的流体动力学，获得显著更低的压力降。对于大多数使用膜包式TFF过滤器的高浓度Ab应用，需降低进样泵，以维持恒定的压力，因为抗体的粘度会不断增加。在HF TFF中，不需要控制进样泵，因为压力增加非常小。此外，使用HF 过滤器时，产物的收获和排空也非常简单，因其没有膜包过滤器通常使用的湍流促进器或筛网。最后，使用一次性HF 过滤器可免去繁琐的清洗、组装、拆装和维护步骤，最终节省传统膜包过滤器使用相关的时间和间接成本。

本应用测试了使用HF膜进行IgG有效浓缩的可行性，并分析了剪切率和跨膜压（TMP）对滤液通量的影响。

材料和方法

系统：KR2i TFF系统（SYR2-U20，SpectrumLabs.com）

过滤器：30kDa mPES，MicroKros（C02-E030-05-N，0.5mm；C02-E030-10-N，1.0mm，SpectrumLabs.com）

样品准备

IgG为商业化产品（Sigma Aldrich），溶解于0.9%盐溶液，至终浓度30mg/mL。实验运行前，溶液使用0.2μm过滤器过滤，去除较大的颗粒。

IgG起始和终浓度使用280nm吸光光度法检测，使用Beer法则计算浓度。ε280=210,000M-1cm-1。

过滤器组件准备

浓缩实验前，过滤器组件润湿，并测试完整性。MicroKros过滤器组件截留分子量（MWCO）为30kDa，含改性聚醚砜（mPES）纤维，在本应用笔记中，实验使用纤维内径（ID）为0.5mm（每根组件含6根纤维，20cm2）或1.0mm（每根组件含2根纤维，13cm2）的组件。组件润湿及完整性测试使用KR2i TFF系统进行。简单来说，过滤器组件用DI水冲洗，直至每cm2表面积滤液体积为2ml。使用泄漏实验，测试纤维和组件完整性。组件完全润湿，纤维外腔（ECS）用水完全浸没。回流端关闭，通过入口，向组件内缓慢导入空气。当跨膜压（TMP）达到~0.5psi时，停泵。ECS内无气泡，且进样压力恒定，说明为完整过滤器组件。完整性检查后，使用0.9%盐溶液润洗过滤器，直到收集到2mL/cm2的滤液。

浓缩实验

浓缩实验使用KR2i TFF系统进行。实验使用纤维内径0.5和1.0mm的HF膜，剪切为6,000S-1。使用整合式KF Comm软件采集数据（流速、压力等）。IgG溶液（30mg/mL）加入锥底容器（含3导管盖，SpectrumLabs.com）。滤液管路连接至收集容器。浓缩过程通过测量收集的滤液的质量来监测，由KF Comm软件自动检测。在3秒钟内，缓慢增加泵速，至所需流速（6,000S-1剪切），将蛋白溶液泵入组件。KR2i系统设置为浓缩（C）模式。

剪切率实验

为测试不同剪切率对滤液通量的影响，将IgG溶液（~100mg/mL）循环通过HF膜。为保证整个工艺过程中，IgG浓度恒定，IgG溶液用0.9%盐溶液连续洗滤。系统设置与C模式一致，但将锥底样品容器的第3根导管连接至装有缓冲液的辅助容器，而不是连通空气。流路通过工艺过程中形成的真空，向IgG溶液中连续添加缓冲液，速度与滤液流速一致。剪切率实验以可提供适当剪切率的流速进行，不施加背压。实验使用含0.5和1.0mm内径HF膜的过滤器组件进行，数据采集使用KF Comm软件。

跨膜压（TMP）实验

通过在恒定剪切率条件下，向回流管路施加背压，测试跨膜压（TMP）对过滤器性能的影响。实验使用含0.5和1.0mm内径HF膜的MicroKros过滤器组件进行。实验使用剪切率6,000和10,000S-1。实验设置与剪切率实验相似，只有一个需要注明的不同。按浓缩/洗滤（C/D）模式，使用一个二级洗滤泵向蛋白溶液中连续补加缓冲液（0.9%盐），以在整个实验过程中，维持恒定的30mg/mL的IgG浓度（浓缩因子设置为1，以使洗滤立即开始）。数据使用KF Comm软件采集。

结果和讨论

浓缩实验（0.5mm内径）

起始实验中，我们使用HF膜测试了IgG可被浓缩的最大限度。使用含0.5mm内径纤维的MicroKros组件。实验中，将20mL 30mg/mL的IgG溶液（0.9%盐溶液）置于50mL含3导管盖的锥底工艺容器中。2根导管分别连接至组件的进样和回流管路，第3根导管连通空气。

滤液管路关闭，IgG溶液缓慢泵入管路和组件。当循环流速恒定后，打开滤液管路，开始浓缩。在此实验中，不施加外部背压（通过回流管路），所以，随溶液浓度增加而导致的粘度的增加，TMP增加。进样流速27mL/min（6,000S-1剪切）也保持恒定。

图1.使用含0.5mmID mPES HF 膜的MicroKros组件进行高度浓缩实验时的通量、TMP、压力降（DP）和浓缩因子（CF）数据。

如图1所示，浓缩开始后，TMP立即开始增加。同时，通量开始稳定下降。组件两端的压力降（DP）可作为膜污染的指示，通常是涉及浓缩步骤的工艺的困扰。但是，图1显示，即使在工艺开始60min后，压力降维持在10psig以下。60min之后，压力降开始增加超过10psig，最终达到约25psig，通量降至0L/m2/hr。

使用UV-分光光度法确定IgG溶液的最终浓度，约为350mg/mL，相当于浓缩~12x。

浓缩实验（1.0mm内径）

我们也使用含1.0mm纤维内径HF膜的过滤器组件进行了浓缩实验。该工艺的剪切率保持恒定，为6,000S-1（71mL/min。）TMP通过自动背压阀控制，维持为5psig。结果如图2所示。

图2. 使用含1.0mm ID mPES HF膜的MicroKros组件进行浓缩运行时的通量、TMP、DP和CF数据。运行过程中TMP保持恒定为5psig（除最后数据点）。

如图2所示，1.0mm内径纤维的起始通量高于0.5mm内径纤维（18L/m2/hr vs. 12L/m2/hr）。正如预期，通量随IgG溶液浓度的增加而降低。运行过程中，TMP恒定为5psig，直到接近运行结束时，增加至约10psig。此时，通量降低至0L/m2/hr。图2同时显示，在整个运行过程中，总压力降低于8psig，说明膜污染较低。这表明，1.0mm纤维在浓缩过程中，可获得更好的过滤器通量。

使用UV分光光度法检测IgG终溶液的浓度，计算为约226mg/mL，浓缩7.5倍。使用1.0mm内径纤维需要使用更大的管路，以达到71mL/min的流速。由于滞留体积的增加，不能获得高于250mg/mL的浓度。但是，在优化的条件下，可获得更高的浓度。

剪切率实验

由于使用HF膜进行IgG浓缩时的压力降更低，所以可使用更高的进样流速/剪切率，缩短处理时间。为检测剪切率对滤液流速的影响，将IgG溶液（~100mg/mL）在逐步增加的进样流速/剪切率条件下循环。实验运行不施加背压。

对0.5mm（图3）和1.0mm（图4）纤维，提高剪切率，可增加滤液通量。如图3所示，滤液通量随剪切率提高而线性增加，剪切率从4,000S-1升至12,000S-1时，通量分别从6L/m2/hr增加至10L/m2/hr。但是，需要注意的是，即使不施加背压，在最低剪切率条件下（4,000S-1），最低TMP仍有5psig。当剪切率增加至12,000S-1时，TMP增加至约20psig。

与0.5mm内径HF膜，1.0mm内径HF膜过滤器组件显示滤液通量显著增加，同时跨膜压有较大降低。图4显示，滤液通量增加4倍，从4L/m2/hr增加至16L/m2/hr。重要的是，跨膜压基本保持不变，即使在11,000S-1剪切率时，也不会增加超过5psig。而在TMP 为5psig时，0.5mm内径纤维只能获得约6L/m2/hr的滤液通量。

图4. 使用1.0mm ID HF膜时，提高剪切率对滤液通量的影响。

TMP实验

在我们最后的实验中，我们测试了在给定剪切率条件下，施加背压对过滤器性能的影响。在此实验中，在6,000和10,000S-1剪切率条件下，对含有0.5和1.0mm内径纤维的过滤器组件进行测试，而TMP从5增加至20psig。结果如图5和图6所示。实验使用30mg/mL IgG溶液（0.9%盐溶液）进行。

如图5所示，增加背压对滤液通量会有负作用，使用含0.5mm内径纤维过滤组件，剪切率为6,000S-1时，通量从14L/m2/hr降低至9L/m2/hr。这说明提高背压会增加凝胶层的形成，最终降低过滤器性能。有意思的是，当剪切率增加至10,000S-1，且TMP恢复至5psig，滤液通量增加至18L/m2/hr，这说明增加的流速可从膜表面清扫并去除沉降的IgG。此外，将TMP增加至10、15和20psig，对滤液通量不会有不利的影响，说明在10,000S-1下，增加的剪切率可有效且连续地冲扫膜表面。而即使在较高的TMP条件下，这种冲扫作用防止了凝胶层的形成。

图5.通过背压提高TMP时，对0.5mm内径HF膜的影响。

图6所示为使用含1.0mm内径纤维过滤器组件时，进行的一致的实验的结果。可见，在剪切6,000或10,000S-1时，滤液通量不会随TMP的增加而降低。在所有测试的TMP条件下，剪切率为6,000S-1时，通量维持约为15L/m2/hr。剪切率为10,000S-1时，当TMP从5增加至20psig，通量从20稍微提高至23L/m2/hr。

图6. 通过背压提高TMP时，对1.0mm内径HF膜的影响。

总结

这里，我们描述了使用含0.5和1.0mm内径纤维的HF 过滤器组件进行IgG浓缩的工艺。本应用笔记显示，使用Spectrumlabs.com的HF膜，IgG浓度可浓缩至350mg/mL。此外，我们发现，0.5和1.0mm内径膜在此实验中，存在性能差异。

这些实验显示，含1.0mm内径纤维的过滤器组件更适合Abs的浓缩。使用1.0mm内径纤维可获得更低的压力降和更高的通量，从而缩短处理时间。

同时，我们发现，对工艺施加背压不会显著提高滤液通量。在某些情况下，背压会降低滤液通量。当然，每一个工艺都需要其自身的一系列实验，以优化参数，但这些结果可作为一个良好的起始点（如6,000-8,000S-1，不施加背压）。

总结来说，使用SpectrumLabs.com的HF膜，可快速、温和、稳定地获得高Ab浓度，从根本上降低产物损失。此外，由于HF过滤器组件的几何结构和排空能力，产物隔离保持在较高水平，进一步提高了产物的收率。综合这些IgG实验结果，相似的工艺可用于mAbs的纯化。

参考文献：

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