液滴法连续合成单分散PLGA颗粒

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2021-07023  环球过滤分离技术网  guolvfenlitech6

API在均匀聚合物颗粒中的可控可重复封装

摘要

本应用报告描述了使用Dolomite液滴微流控PLGA封装系统制备尺寸为10至45μm的高单分散聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）颗粒的方法。

本文所述的颗粒制造方法依靠聚合物在溶剂中溶解，然后使用液滴微流控芯片乳化。这种方法的主要优点是得到的颗粒具有高的单分散性和逐批一致性。还有一个优点是，在不改变硬件的条件下，可以在一个系统上可控的实现很宽的颗粒尺寸范围。

我们在一系列试验条件下进行操作，其中液滴流和载液流之间的相对流动条件是变化的，所得到的液滴尺寸和液滴速率均做了记录。这描述了液滴的收集和从液相到固相的转化过程。

测试所获得的关键参数有：

•液滴流量范围：0.5 – 30 μL/min

•载液流量范围：10 – 125 μL/min

•液滴尺寸范围：35 – 101 μm

•颗粒尺寸范围：12 – 44 μm (2μm颗粒在有些单独测试中出现)

•最大液滴生成速率: 14 kHz

•使用的聚合物浓度：1%, 2%, 10%, 和20 % (w/v)

•高单分散颗粒(＜5%CV)

介绍

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种具有广泛用途的聚合物，由于其生物降解性和生物相容性，可作为药物传递的载体，并作为美国食品和药物管理局批准的几种疗法的基础。

大家认识到有必要制备高度单分散的颗粒，用于药物可控释放和靶向给药等应用。

在这些应用中，对颗粒尺寸分布的精确控制尤其重要，因为它对体内的选择分离（增强渗透性和保留效应）有显著影响。此外，颗粒的大小决定了降解速率，从而决定了药物释放速率。颗粒尺寸对比表面积和体积比有显著影响，从而影响功能涂层基团的数量。在靶向药物递送应用中，这反过来决定了颗粒对定位到特定位置的偏好。

由于PLGA颗粒的可控降解，API长时间不断释放

传统的乳液制备PLGA颗粒的方法在每批产品中都会产生多种直径范围的颗粒。通过控制剪切能的输入，尺寸选择的程度也是有限的。

本文提出基于微流控的方法产生高度单分散的颗粒，从而提高了工艺的收率。

材料和方法

采用微流控法生产PLGA颗粒是通过液滴的形成和溶剂的萃取来实现的。使用两种部分混溶的溶剂二氯甲烷（DCM）和水。PLGA溶解在DCM中形成液滴。水性表面活性剂混合物形成连续相流体。表面活性剂吸附在液滴与载体之间的流体界面上，使乳液稳定。

1. 系统设置

实验使用Dolomite公司PLGA颗粒封装系统， 一个高达10bar的氦气气源连接到压力泵。这与系统的流阻一起防止了DCM-PLGA溶液释放气体。释放气体会导致系统中聚合物不受控制的沉淀，从而产生流动不稳定性（在某些极端情况下会造成堵塞）。系统的连接示意图如下：

用于制造PLGA颗粒的微流控装置示意图

2. 微流控芯片

采用100μm亲水性3D聚焦流芯片（PN：3200433）制造液滴。3D聚焦流设计最大限度地减少了后通道壁的沉淀，并使芯片长时间运行无堵塞风险。这是由于液滴形成节点出口侧的特殊“孔”结构，该结构在液滴形成节点处产生三维层流。这种流动模式在处理容易污染芯片节点的液滴时特别有效。

软件控制的高速成像系统（PN：3200050）观测微流控芯片的液滴生成节点处，实现了可视化。

3. 试剂

三个压力泵中分别装有液滴流，启动流和载液流。

液滴流	二氯甲烷+PLGA
启动流	二氯甲烷
载液流	水+2%PW11水性表面活性剂混合物

· 启动流：二氯甲烷（DCM）通过0.2μm过滤器，无需进一步处理即可使用。

· 液滴流制备：PLGA在室温下通过一小时的搅拌溶解在DCM中。制备10 ml体积的4种浓度1%、2%、10%和20%（w/v）。

· 载液流：2%PW11表面活性剂混合物通过0.2μm过滤器，无需进一步处理即可使用。

试剂	供应商	货号
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) – ester terminated, lactide:glycolide 75:25, Mw 76,000- 115,000	Sigma Aldrich	719927
Dichloromethane – CHROMASOLV®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer	Sigma Aldrich	34856
2% PW11 surfactant blend	Particle Works	7206001

结果

液滴形成后，DCM开始向周围水相扩散（DCM在室温下在水中的溶解度为2%（v/v）），从而耗尽液滴中的溶剂。液滴中的溶剂消耗增加了PLGA的浓度，直到达到过饱和，PLGA颗粒沉淀下来。由于每个液滴周围有足够多的水，溶剂的扩散释放会继续进行。最终，当大部分溶剂从液滴中除去时，液滴中的固体被留了下来。在此阶段，液滴转化为PLGA颗粒。溶剂的去除会导致体积和大小成比例的减小。因此，液滴的尺寸明显缩小。

为了演示估算尺寸变化的工作流程，使用下表中的测试条件收集样本。

用像素分析软件测量液滴的大小。以100μm的通道宽度作为参考尺寸，利用高速成像系统以1kHz的帧率、592px×144px的像素尺寸记录液滴产生的视频。

当液滴产生速率高于视频捕获速率时，记录静止图像。这足以测量液滴的大小。然后通过以下方法估算液滴速率：

Droplet rate (Hz) = Droplet phase flow rate (μL/s) / Droplet volume (μL)

液滴收集在小瓶中。该小瓶预先填充100μL载液（水+2%PW11水性表面活性剂混合物）

左图：出口管浸入收集液。右图：液滴从管中流出，通过水相落下，在小瓶底部聚集

溶剂去除是通过二氯甲烷从液滴中扩散，穿过液滴/载液界面，进入载液实现的。二氯甲烷从收集的样品中逐渐去除，并排放到大气中。留下的是固化的PLGA颗粒悬浮在载液中。

溶剂去除概念分子示意图

在大量水溶液存在下，溶剂不断地从液滴中扩散出来。残余的疏水聚合物形成一个比初始液滴更小的微粒。表面活性剂分子（上图未示出）在有机液滴和水载体之间的流体界面处自组装：表面活性剂分子的疏水部分侵入液滴，而亲水部分向外延伸。

为了收集和分析少量样本，从收集瓶中取出出口管，将样本收集在一个小玻璃盖玻片上。在显微镜下观察盖玻片，并在固定的时间间隔内记录图像。

箭头表示DCM从液滴到水的转移路线

聚合物液滴沉淀在玻璃盖玻片上的水滴底部。盖玻片没有涂层，因此具有亲水性，与液滴芯片的表面相同。DCM有足够的暴露表面积，可以从聚合物液滴转移到周围的水中，并最终扩散到大气中。

下面的图像按顺序显示了所采集样品随时间的变化。

每相隔30秒的图像。尺寸预估的像素分辨率为1.77μm/px

从液滴之间的差异可以看出溶剂去除的变化。然而，由于是单分散的，所有的液滴都具有相同的初始尺寸和最终尺寸

选择一个液滴/颗粒，并在溶剂去除过程中持续跟踪，记录尺寸。

跟踪液滴的收缩

芯片上一旦形成液滴，收缩就开始了。因此，当在显微镜下跟踪尺寸时，尺寸已从101μm减小到95μm。图表显示液滴的最终尺寸为23μm。

Shrinkage = (Size of droplet) / (Size of particle)

在上述试验条件下，收缩率为101μm/23μm=4.36。在最终尺寸时，液滴失去了大部分DCM成分，留下了一个半凝胶状的PLGA颗粒。

左图：显示不同聚合物浓度下的最终粒径与起始液滴粒径的关系

右图：不同聚合物浓度下的收缩率与起始液滴尺寸

液滴尺寸与颗粒尺寸

溶剂的去除速率与去除方法密切相关。在盖玻片上，有很大的表面积可供蒸发，因此溶剂去除过程在可在几分钟内完成。在柱法、溶剂交换法中，溶剂的去除可能需要较长的时间，且需要更多的控制。

液滴尺寸随流量比（液滴流量/载液流量）的变化而变化。结果和液滴图片的完整列表见附录。液滴的收缩取决于不同的物理参数，如流动比、界面张力和流体粘度。液滴在芯片上产生，并在芯片外收集，以便从液相转化为固相。在这个转化阶段，表面活性剂充分稳定了乳液。

液滴产生速率

Polymer concentration	Maximum droplet rate
1% (w/v)	14,007 Hz
2% (w/v)	10,996 Hz
10% (w/v)	2,832 Hz
20% (w/v)	471 Hz

结论

液滴微流控技术已被证明是制备高单分散性和尺寸均匀性PLGA颗粒的有效工具。

微流控技术可以通过改变载液相和液滴相的流速，以及改变液滴相中PLGA的浓度，实现对颗粒尺寸的无缝控制。在这项工作中，在相同的微流控系统上获得了尺寸12μm到44μm的颗粒，硬件不需要改变。

在本研究中获得的样品的显微镜图像显示出极高的颗粒均匀性，这可以实现颗粒的均匀降解和药物均匀释放。

Dolomite公司的Telos多通道平台，可以扩大PLGA颗粒的产量。

附录： 液滴直径和速率

下面表格显示了许多不同试验条件下的液滴尺寸和速率。每种测试条件在两条流体管路上的设定流速上都不同。

1.1.1 1% PLGA solution

1.1.2 2% PLGA solution

1.1.3 10% PLGA solution

1.1.4 20% PLGA solution

1.1.5 结果的图形表示

左图：3种液滴流速下，液滴尺寸随载液流的变化

右图：3种液滴流量相同时，尺寸大小和液滴速率的依赖关系

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