超滤在生物医药领域的应用

nanopuretech1 · 发表于 2021-7-15 08:15:28

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2021-07-15 环球过滤分离技术网 nanopuretech1

摘要：切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF），即超滤，是一种已经被广泛采用的过滤操作方式，它的应用包括澄清过滤、产物浓缩、除热原、除小分子杂质、脱盐和缓冲液置换等等。本文将以超滤为切入点，详细介绍其在生物制药领域的广泛应用。

背景介绍

超滤或切向流过滤是一种介于微滤与纳滤之间的能将溶液进行分离、浓缩、透析的膜分离技术。切向流过滤的概念是相对于常规过滤（Normal Flow Filtration，NFF ）而言的，如下图1 所示。常规过滤是指在压力的作用下，液体直接穿过滤膜进入下游，而大的颗粒或分子则被截留在膜的上游或内部，小的颗粒或分子透过膜进入下游。在这种操作方式下，液体的流动方向是垂直于膜表面进入下游的，所以也有人称之为“死端过滤”（Dead End Filtration）。常规过滤的应用包括澄清过滤、除菌过滤和除病毒过滤等等，不是本文讨论的重点。而切向流过滤则是指溶液沿着与膜平行的方向流动，在压力的推动下，小于膜孔的分子透水膜，成为透过液，比膜孔大的分子被截留，成为浓缩液,这种操作方式也有人称之为“错流过滤”（Cross Flow Filtration）。由于切向流在过滤过程中对膜包的表面进行不停的“冲刷”，所以在这种操作模式下有效的缓解了大的颗粒和分子在膜上的堆积，这就使得这种操作模式在很多应用中具有独特的优势。

图 1 常规过滤与切向流过滤示意图

超滤在生物制药有广泛的应用，如在澄清过滤、产物浓缩、脱盐和缓冲液置换等等（图2）。

图2 超滤的应用

下图3为典型切向流过滤系统的示意图，通常包括泵、膜包和夹具、贮罐、连接管件以及阀门和压力表等。

图3 超滤系统示意图

超滤

膜材质的选择

常用的膜材质包括聚醚砜和再生纤维素（表1），这两款膜材质都具有高截留率、高通量、易清洗。

• 聚醚砜具有杰出的PH兼容性，耐酸碱的清洗。

• 再生纤维素亲水性高，蛋白吸附性低，不耐强碱，对清洁和消毒有一定的限制。

表1 膜材特性（PES、RC）

膜孔选择

• 希望目标物质透过膜孔，一般选择膜截留分子量为目标物质分子量的5-10倍或以上。

• 希望目标物质充分截留，一般选择膜截留分子量为目标物质分子量的1/3- 1/5

表2 生物制品膜孔径的选择

超滤清洗

膜包清洗主要是为了去除膜污染物、保持膜性能、减少批间污染。污染物包含微生物、颗粒、蛋白、色素等。所以清洁需要根据污染物的性质、膜材质的耐受性来选择。常见的清洁剂有酸（柠檬酸、乙酸、磷酸等）、碱（氢氧化钠、次氯酸钠）和表面活性剂（SDS、吐温、Triton X100）。表3 为常用的清洁剂和清洁条件，根据膜的耐受性可以调控清洁剂的溶液浓度、处理时间。

表3 常用清洁条件

保存方法

• 短期保存（＜1个月）：可将将膜包保持在夹具。小于3天的存放使用0.2μm过滤过的超纯水、20%乙醇、0.05N-0.1N的NaOH；小于1个月的存放使用0.1N的NaOH

• 长期存放（＞1个月）：从夹具中取出膜包，并将其密封到塑料袋中。将约50-100mL的0.05N-0.1N的NaOH储存溶液加入塑料袋中并密封，确保存储溶液完全覆盖膜包，并将密封袋存放在4°C的环境中。

表4 保存条件

市面上比较常用的是Millipore的产品。近年由于新冠疫情的影响，供应链都受到较大的挑战，很多大的制药公司也将目光转到比较出色的国产厂家，例如科百特。科百特主要为全球生命科学和工业领域的客户提供多元化服务，为客户提供先进的解决方案，帮助他们探索、研发和生产生物制品、疫苗、细胞治疗和通用药品。从实验室规模到中试规模在到生产规模，科百特都为客户提供比较完善的整体解决方案。

图 4 膜包及夹具和超滤系统

超滤应用点：

1、生化制品的分离提纯、浓缩、脱盐、脱醇（胸腺肽、肝素钠、细胞色素C等）2、基因工程产品的分离提纯、浓缩、脱盐（干扰素、EPO、TPO、G-CSF等）3、血浆蛋白的分离、浓缩、脱醇（白蛋白、球蛋白、凝血因子等）4、细胞培养产品的分离、浓缩（病毒、抗体等）5、蛋白产品层析前后或冻干前的缓冲液置换6、细胞、菌体及病毒的收集7、发酵液或培养液的澄清，去除菌体和细胞碎片8、小分子产品除热原（如：葡萄糖、抗生素、小肽等）

案例分享

一个切向流过滤的生产工艺由许多参数决定，其中关键的工艺参数有：切向流流量、跨膜压（TMP）、透出液控制、膜面积、透析条件等。这些参数既相互影响又相互制约，要同时达到提高生产效率和节约成本的目的，就必须首先对这些参数进行优化。这些参数通常需要由经验、实验以及具体工艺的需要和各种限制因素结合起来才能确定，因此切向流过滤是一个相当复杂的过程。下面即是根据产品的性质进行相应优化的案例。

慢病毒超滤浓缩

膜包：Consieve®UET 300kDa，0.11m2

结果：浓缩通量56LMH，透析通量42LMH；病毒滴度106→107TU/ml。明显提高了后续的感染PBMC试验效果。

图5 慢病毒超滤浓缩优化

糖苷超滤浓缩透析

膜包：Consieve®UET 10kDa，0.11m2

结果：1.浓缩通量23.6LMH，透析通量23.3LMH；2.透过液有效物质未检出，说明完全截留；3.与透析袋比较：2day→2h

图6 糖苷超滤浓缩优化

酶制剂的浓缩

膜包：Conseive® UET膜包，0.11㎡ 10kD

结果：选择进液流量5.3 L/min/m2，根据TMP& flux曲线，最优的TMP 为0.4～0.65bar （图7），target0.5bar。在进液流量5.3 L/min/m2、进液压力1.0bar、TMP 0.5bar的条件下超滤实验，随着浓缩的进行，浓缩倍数升高，膜通量逐步降低，实验的膜包平均通量为35.5LMH （图8）。

破伤风类毒素发酵液超滤浓缩

膜包：Consieve® UET 30kD膜包（0.11m2）。

结果：设置进液流量5.5 L/min/m2，最佳TMP在0.9bar左右（图9）。在进液压力1.4bar，回流压力0.5bar，TMP为0.95bar，进液流量为5.5 L/min/m2，进行超滤浓缩实验（10倍浓缩，图10），超滤浓缩过程中，随着料液浓缩，膜包通量呈下降趋势，通量从最初的46.4LMH下降到31.2LMH，膜包平均通量为38.4LMH，收率为107%（包含检测误差）。