鼠细小病毒质量对除病毒过滤验证的影响

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2025-04-11             环球过滤分离技术网              guolvfenlitech6

中文摘要

目的 探讨鼠细小病毒（minute virus of mice，MVM）质量对于除病毒膜过滤验证的影响。

方法利用病毒浓缩试剂盒和Sartobind Q离子交换膜在不同条件下对MVM进行两步纯化。采用滤器Virosart HF和Viresolve® Pro Micro Device，使用纯化的MVM进行2种抗体的纳米膜过滤除病毒验证。

结果 在2种抗体的纳米膜过滤除病毒过程中，加入两步纯化MVM的样品与未加毒的样品相比通量衰减分别仅从9%增至12%和23%，而加入仅经过病毒浓缩试剂盒纯化的MVM分别从9%增至26%和55%。

结论 MVM纯度的提高可改善除病毒过滤验证中的通量衰减。

正文

动物源性细胞表达的生物制品中，病毒污染风险是一个主要的安全问题。我国药品审评中心发布的《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》中指出，必须高度重视动物组织细胞来源生物制品病毒安全性，应进行规范的病毒去除/灭活验证研究。鼠细小病毒（minute virus of mice，MVM）为线性、单链、长度约5 kb的DNA病毒，直径18~26 nm，呈二十面体对称。MVM在极端环境下不易被清除或灭活，对于以啮齿动物来源的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞生产的生物制剂，MVM是实验室规模病毒纳米膜过滤实验中最常用的指示病毒之一。

纳米膜过滤基于大小的筛选机制可以完整保留病毒，是实现病毒清除的最稳健和有效的下游方法。病毒过滤膜由聚偏氟乙烯、聚醚砜或再生纤维素等亲水聚合物构成包含孔隙和毛细管道的复杂网络，其孔径明显小于大多数病毒。

此研究拟以不同纯化方法制备MVM，用于单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）纳米膜过滤法清除病毒实验，以考察不同纯度的MVM对膜过滤实验的影响。

1

材料与方法

1.1

主要试剂与仪器

DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国LIFE公司，胎牛血清购自法国Biowest公司，病毒浓缩试剂盒购自吉满生物科技（上海）有限公司，DNA处理试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司，氯化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均购自国药集团化学试剂有限公司，研究所用试剂均为分析纯试剂。AKTA Purify 100智能蛋白纯化系统购自美国GE公司，1ml Sartobind Q离子交换膜、Virosart Max滤器、Virosart HF滤器、Vivaspin超滤管均购自德国赛多利斯公司，Viresolve® Pro Mirco Shield Kit滤器、Viresolve® Pro Micro Device滤器均购自美国默克密理博公司。

1.2

病毒及细胞

MVM（ATCC®VR-1346®）、A9细胞（ATCC®CCL-1.4TM）均购自美国典型培养物保藏中心，由上海生物制品研究所有限责任公司第七研究室传代保存。

1.3

mAb

mAb A和mAb B由上海生物制品研究所有限责任公司提供。

1.4

方法

1.4.1 病毒制备以感染复数0.1接种MVM于A9细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 °C、5% CO2培养2~4 d，冻融3次，3 000~5 000×g离心20 min，收集上清液为粗制病毒悬浮液。粗制病毒悬浮液采用病毒浓缩试剂盒进行浓缩纯化，按照产品说明书进行，具体如下：病毒上清液与试剂盒中的浓缩液按照体积比4 ：1混合，4 °C孵育2 h或过夜。开始时每隔30 mm混匀，混匀3次。于4 ℃、4 000×g离心25 min，离心后的白色沉淀用DMEM或平衡液（20 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L NaCl， pH7.5）重悬，得 Grade 1 病毒液，重复制备3批，于-70 ℃冰箱保存。

1.4.2 离子交换膜病毒纯化 采用平衡液将离子交换膜冲至平衡，上样Grade 1病毒液。采用0~700 mmol/L氯化钠溶液对柱子洗脱30个柱体积，收集洗脱液，每管3 ml，直至吸光度值与基线持平时结束收集。根据梯度洗脱的结果，配制A液、B1液、B2液、B3液、C1液、C2液、C3液，分别含20、100、150、200、400、500、600 mmol/L NaCl，均含20 mmol/L的Tris-HCl， pH7.5。对 Grade 1 病毒液进行纯化，收集洗脱液，加入超滤管，3 000×g离心至截留液1~2 ml，加入B2液，重复2~3次，至截留体积为目标体积，得Grade 2病毒液。

1.4.3 病毒液中蛋白的测定病毒液中蛋白含量的检测采用Bradford检测方法，在96孔板中检测595 nm处吸光度。

1.4.4 DNA含量测定采用DNA样本（磁珠法）处理试剂盒进行检测。具体方法如下：将样品进行适当比例的稀释，然后加入蛋白酶K消化液振荡混匀，55 ℃水浴1 h进行消化；加入工作结合液、200 μl异丙醇，10 μl磁珠对DNA进行吸附，分离磁珠，加入洗涤液A和B，使磁珠和洗涤液混匀进行洗涤，弃上清液，开盖干燥；加入预热的洗脱液混匀后70 ℃水浴10 min，分离磁珠；上清液即为DNA纯化液，紫外可见分光光度计测定浓度和纯度。

1.4.5 病毒膜过滤实验将mAb A采用Virosart Max滤器进行预过滤后，加入制备的MVM，保证样品中滴度大于4.50 lgTCID50/0.1 ml，然后采用Virosart HF进行病毒膜过滤实验，过滤器面积为5 cm2，过滤压差为0.21 MPa，滤膜孔径20 nm；将mAb B 采用Viresolve® Pro Mirco Shield Kit 进行预过滤，然后加入制备的MVM，保证样品中滴度大于4.50 lgTCID50/0.1 ml，再采用Viresolve® Pro Micro Device进行病毒膜过滤实验，过滤器面积为3 cm2，过滤压差为0.21 MPa，滤膜孔径20 nm。手动记录随时间收集的累积滤液数据，并计算通量、载量。

1.4.6 滴度检测将A9细胞以2×105 ml-1接种于96孔板，每孔150 μl，将MVM用无血清DMEM培养基进行10倍系列稀释（10-1—10-8），接种于96孔板，采用细胞病变法滴定病毒滴度（TCID50），每日观察A9细胞病变，7~10 d判定，Reed-Muench法计算残余MVM含量。

2

结果

2.1

离子交换膜病毒纯化

随着氯化钠浓度升高，系统检测到的电导值也升高，当电导值开始上升时，进行收样，直至电导值达到平衡后停止收样，并检测所有样品中MVM滴度和蛋白浓度，当缓冲液中氯化钠浓度为200~600 mmol/L时，病毒滴度较高，如表1所示。

表2显示，在洗涤液中氯化钠浓度为100 mmol/L时，未洗出可感染病毒，随着氯化钠浓度增加，MVM被逐渐洗出，可初步得出洗涤液氯化钠浓度为100 mmol/L，洗涤液病毒滴度到检测下限，而洗涤氯化钠浓度达到150 mmol/L时洗涤液中可检测出较高滴度病毒。由于洗脱液氯化钠浓度为400~600 mmol/L时，洗脱效果相差不大，因此采用400 mmol/L氯化钠浓度。

2.2

不同工艺制备的MVM比较

根据1.4.1和1.4.2的方法，制备不同级别的MVM，数据见表3。粗制病毒悬浮液即为经过冻融、低速离心后的病毒悬浮液，病毒滴度因批次不同而有差异，蛋白浓度约在3~5 mg/ml。将粗制病毒悬浮液浓缩纯化后得到Grade 1的蛋白含量差异较大，推测该步骤为非特异性沉淀，会导致数量不同的非病毒蛋白沉淀，DNA存在同样的问题，证明单这一步对于过程相关杂质的去除是不可靠的。尽管如此，该步骤仍去除大部分杂质。Grade 2受Grade 1的影响，各个批次之间蛋白质、DNA水平仍存在一定差距，但差距明显变小，说明Grade 2可以进一步有效去除杂质，提升病毒质量。

2.3

病毒膜过滤实验结果

图1显示，Grade 1—Lot 1制备的MVM滴度为7.20 lgTCID50/0.1 ml，为保证样品中MVM终滴度大于4.5 lgTCID50/0.1 ml，采用5%的加样策略，可见通量显著下降，但将病毒加样比例下降至1%，通量显著改善。将同等病毒加样比例的Grade2—Lot 1与 Grade 1—Lot 1加入 mAb A中，载量为400 L/m2时，通量衰减分别为12%和26%，而未加病毒的mAb A此时的通量衰减为9%。在实验过程中，出现未加病毒的mAb A样品起始通量低于加病毒mAb A样品的起始通量的现象，考虑为除病毒膜的批间差异和料液的批间差异因素。将同等病毒加样比例的Grade 2—Lot 1与Grade 1—Lot1加入mAb B中，载量为1 000 L/m2时，通量衰减分别为23%和55%，而未加病毒的mAb B此时的通量衰减为9%。由此可见，Grade 2—Lot 1制备的病毒质量在除病毒过程中的表现明显优于Grade1—Lot 1，与其蛋白浓度水平、DNA水平表现一致。表4显示在本次实验中，虽均未出现病毒突破现象，但在样品中加入病毒，对除病毒膜的通量有着明显的影响。除此之外，同等质量的病毒加入不同样品（即mAb A、mAb B）中，使用不同厂家的除病毒纳米膜过滤器，其通量分布也不相同。

3

讨论

对于以啮齿动物来源的哺乳动物细胞如CHO生产的生物制剂，采用膜过滤除病毒是常用的物理手段，其中MVM是最具挑战性的病毒之一，因为mAb和许多其他治疗性蛋白质的单体直径通常为4~12 nm，而MVM的直径为18~26 nm，在过滤目标产品的同时需要100%截留住MVM是一个不小的挑战。目标产品的聚集、病毒液中的杂质和病毒的聚集体被认为是膜过滤器堵塞的主要原因，另外当样品的成分与病毒液的成分结合时，可能会发生相互作用，也会降低过滤器的性能。

病毒的质量和选择对于病毒去除过滤研究的成功验证至关重要，并最终会影响其商业生产过程的总体成本。通过实验发现，为了提高样品在除病毒过滤中的载量，可以将病毒液进行一定比例的稀释，但是这一方法受到病毒液本身滴度的限制。本研究在通过离心获得粗制病毒液后，采用病毒浓缩试剂盒对病毒进行浓缩纯化，结果显示使用该试剂盒后不但可以提高病毒滴度还可以大量去除杂蛋白，该方法操作简单，无需复杂的仪器设备，可用于代替超速离心、蔗糖梯度离心、中空纤维柱浓缩等方法，与粗制病毒悬浮液比较，这一步对杂蛋白的去除具有巨大贡献。但通过实验结果发现该方法也存在纯化效果不稳定的缺陷。在此基础上，本研究采用了 Sartobind Q离子交换膜对MVM进行进一步纯化，对层析条件进行了探索，发现在不同离子浓度的洗涤液以及洗脱液中病毒滴度差异较大，可初步得出洗涤液氯化钠浓度100 mmol/L、洗脱液氯化钠浓度400 mmol/L为病毒纯化的最优条件。将不同质量的MVM用于2种不同的产品进行膜过滤实验，实验结果显示，病毒自身质量的提高大大减缓了除病毒过程中通量的衰减，从而提升了样品的过滤载量。

本实验中，纯化后的病毒液仍存在一定量的杂质蛋白以及杂质DNA，可以考虑通过在后续培养过程中减少血清含量来优化，或考虑通过进一步添加纯化步骤如添加核酸酶处理。病毒纯度越高，在除病毒过滤过程中可以获得更高的病毒滴度对数下降值，符合安全监管要求；病毒纯度越高载量越大，从而可以降低生产过程中过滤器的成本。

作者

是翡1 郭慧1 史云凤1 王闽佳1 吴玮1 刘雪颖2 李冬梅1

1上海生物制品研究所有限责任公司第七研究室，上海 200051；2上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室，上海 200051

通信作者：李冬梅，

Email: ahal@163.com

引用本文：是翡，郭慧，史云凤，等. 鼠细小病毒质量对除病毒过滤验证的影响 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 263-267.

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